Generation of full-length mRNA transcriptome and miRNA target prediction resources utilized in the study of miRNAs associated with response to Moritella viscosa infection in Atlantic salmon

Sammendrag

Laks (salmo salar) er en viktig oppdrettsart for akvakulturnæringen. En av utfordringene for oppdrettslaks og villaks er smittsomme sykdommer. Blant disse er bakterien Moritella viscosa som forårsaker vintersår. Denne sykdommen forårsaker redusert livskvalitet og høy dødelighet blant oppdrettslaks. Som en del av arbeidet for å bekjempe denne typen sykdommer har forskere studert det genetiske grunnlaget for laksens respons på infeksiøse sykdommer. En type gener av særlig interesse er mikroRNA (miRNA). Disse spiller en viktig rolle i regulering og finjustering av ekspresjons-nivået til bestemte proteiner i mange arter ved å lede et stort enzymkompleks til spesifikke mRNA-transkripter (målgener). Mange slike målgener er nøkkelgener i immun-gen nettverk. Det har til nå vært vanskelig å studere funksjonene til miRNA i laks fordi målgenene er lite kjent. Dette skyldes blant annet manglende tilgang på 3’UTRer fra full-lengde sekvenserte transkripter. Karakterisering av kodende gener har generelt vært særlig utfordrende i laks på grunn av en salmonide-spesifikk hel-genom duplisering. Massiv parallell-sekvenserings metoder, som til nå har vært benyttet for å sekvensere transkripter, har ikke vært gode verktøy for å karakterisere transkripter når genomet, etter en slik relativt nylig hel-genom duplisering, har mange nesten identiske paraloge gener og pseudogener. I dette prosjektet benyttet vi hybrid-korrigering av PacBio SMRT-sekvenserte transkripter og en egenutviklet bioinformatikk-pipeline for å generere et de novo full-lengde mRNA transkriptom med komplette UTRer. Denne transkriptom-ressursen med 71 461 komplette transkripter fra 23 071 loci ga eksperimentell verifisering av 25% av referansetranskriptene for laks i refseq databasen. De fleste av transkriptene var imidlertid nye varianter av kjente gener (70% av transkriptomet). UTR-sekvensene til disse transkriptene og alle kjente miRNA fra laks ble benyttet i in silico prediksjoner for å finne sannsynlige målgener for hvert enkelt miRNA. Denne metoden var basert på vektet gjensidig bekreftelse, slik at hvert målgen var støttet av RNAhybrid-algoritmen samt minst to av de tre lignende prediksjonsalgoritmene vi benyttet for målgenprediksjoner. Det endelige settet med målgener for hvert miRNA ble publisert som en søkbar database (MicroSalmon). Denne databasen lar også brukere søke opp den funksjonelle (biologiske) annoteringen for alle de ulike målgenene. Databasen inneholder videre en oversikt over andre kjente og potensielt nye cis-regulatoriske elementer i UTR sekvensen til alle laksetranskriptene. Disse ble også identifisert via in silico metoder. Full-lengde transkriptomet og MikroSalmon var essensielle ressurser som ble benyttet i siste del av prosjektet. I denne delen identifiserte vi miRNA og proteinkodende gener som endret uttrykk i fisk smittet med M. viscosa. Disse analysene identifiserte 52 biologisk viktige miRNA (guide miRNA) og ~4500 mRNA som responderte på infeksjon med M. viscosa. De samtidige endringene i ekspresjonsnivå mellom miRNA og mRNA ble lagt til grunn for identifikasjon av målgener for de 52 guide miRNAene. Søk etter målgener i MicroSalmon ble derfor begrenset til de ~4500 M. viscosa-responderende transkriptene. Målgenene ble videre brukt i anrikelses-analyser som bekreftet at miRNA målgenene var overrepresentert i immungen nettverk og andre prosesser relatert til sykdomsrespons som sårheling, celledød, og respons til stress og blødning. Denne responsen fremstår som delvis organspesifikk. Det var en overvekt av gener relatert til generelle immunfunksjoner og produksjon av nytt blod i hodenyreprøver, mens hud og muskelprøvene nær sår hadde en overvekt av gener relatert til celledød og vekst av nytt vev. Disse resultatene samsvarer godt med studier fra andre arter, som også indikerte at mange av miRNAene identifisert som sykdomsresponderende i laks har viktige roller i lignende prosesser selv i fjernt beslektede arter. Analysene identifiserte også noen sykdomsresponderende miRNA som er spesifikke for teleost-fisker, deriblant miR-2188 og miR-7132. Denne studien gir ny viktig kunnskap om rollene til mange miRNA i respons på bakterielle infeksjoner i laks. Disse funnene kan legges til grunn for undersøkelser av fremtidig anvendelse av disse miRNAene ved biomarkør-assistert oppdrett av laks, eller som diagnostiske infeksjonsmarkører. Manipulering av deres uttrykk kan potensielt også være et terapeutisk virkemiddel som kan redusere skadevirkningene av M. viscosa-smitte i oppdrettsnæringen.